三、自噬過程進(jìn)行觀察和檢測

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(AV1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(AV2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。細(xì)胞再次長到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。( autophagic vacuolo AV )

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時(shí)長，不利于監(jiān)測(Monitoring) 自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。無自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn) 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低。然后去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

3、利用Western Blot檢測LC3-II/比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成自噬形成時(shí)，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計(jì)自噬水平的高低。(注意: LC3對(duì)LC3-II有更高的親和力，會(huì)造成假陽性。方法2和3需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。小鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

雜交瘤細(xì)胞基因測序

雜交瘤細(xì)胞有丟失高特異性高活性的風(fēng)險(xiǎn)，或者細(xì)胞狀態(tài)不好乃至。而經(jīng)過雜交瘤測序，可以獲得相應(yīng)的序列，可以以重組蛋白的方式來穩(wěn)定獲得；其檢測原理為活xi胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。從而使得研發(fā)或生產(chǎn)者不必以雜交瘤細(xì)胞為載體保留該，而可以以堿基序列的形式進(jìn)行保存和傳播交流、鑒定。同時(shí)還可以使用獲得的測序結(jié)果進(jìn)行等知識(shí)產(chǎn)權(quán)方面的申請(qǐng)審批。有時(shí)為了進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)或進(jìn)行人源化等生物工程操作/修飾，有必要了解雜交瘤所表達(dá)的對(duì)應(yīng)的基因序列以進(jìn)一步進(jìn)行生物工程操作與生產(chǎn)。

相較于直接對(duì)進(jìn)行基于蛋白質(zhì)分析的測序相比，得益于基因測序技術(shù)的發(fā)展，雜交瘤測序可以提供的結(jié)果，防止蛋白測序中如亮氨酸/異亮氨酸較難區(qū)分等潛在風(fēng)險(xiǎn)。

細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染及解決方法

黑點(diǎn)污染

黑色的游動(dòng)點(diǎn)能穿透濾膜并在空氣中擴(kuò)散。它們?cè)诘捅剁R下顯示為黑色圓點(diǎn)，在高倍鏡下顯示為可移動(dòng)的黑點(diǎn)。培養(yǎng)液也不渾濁，一般影響較小，因此細(xì)胞仍可使用。通常，黑點(diǎn)污染后，細(xì)胞生長良好，運(yùn)動(dòng)物體無明顯增加，培養(yǎng)基的顏色和透明度無明顯變化。在同一批培養(yǎng)的細(xì)胞中也可以發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。25%胰酶1mMEDTA消化gao丸10min,用胎牛xue清終止消化,用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單細(xì)胞懸液,30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細(xì)胞,再根椐未分化精原gan細(xì)胞表面thy1。

解決方法：黑點(diǎn)對(duì)細(xì)胞生長狀態(tài)沒有明顯影響，細(xì)胞增殖后會(huì)自然消失，因此除了置換外，無需特殊處理。如果細(xì)胞可能被小的運(yùn)動(dòng)點(diǎn)污染，建議增加培養(yǎng)皿細(xì)胞密度，以提高細(xì)胞存活率。

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的常見問題:

Q: 細(xì)胞在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)碎片如何處理？

A: 貼壁細(xì)胞在移除原培養(yǎng)液后，用 PBS 沖洗 2-3 遍；懸浮細(xì)胞離心移除原培養(yǎng)液后，加入 PBS 重懸，離心移除 PBS; 一般建議重復(fù)上述步驟 2-3 遍，用 800-1000rpm 離心 3-5 分鐘。

Q：細(xì)胞凍存能放在 -80℃ 保存嗎？

A：長期保存的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)放在液氮（-196℃）中保存，短時(shí)間（一般 1 周-2 周）可以存放在 -80℃。

Q：培養(yǎng)瓶是用密封蓋好，還是用透氣蓋好？

A：都可以。只是在使用密封蓋培養(yǎng)瓶時(shí)，瓶蓋旋至約 2/3，不要完全擰緊，預(yù)留約 1/3 以便細(xì)胞可以透氣；有些品牌的密封蓋培養(yǎng)瓶的瓶蓋上有適合位置指示標(biāo)志。

Q:何謂 FBS,FCS,CS,HS?

A: Fetal bovine serum(FBS)和 Fetal Calf Serum(FCS)之間沒有區(qū)別，都是指胎牛；FCS 不是正規(guī)命名，盡量不使用。Calf Serum（CS）則是指小牛。Horse Serum(HS)則是指馬。