三、自噬過程進行觀察和檢測

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(AV1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(AV2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。細胞再次長到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規凍存(凍存液要現配)。( autophagic vacuolo AV )

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長，不利于監測(Monitoring) 自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發生聚集的現象開發出了此技術。無自噬時，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。然后去固定液，加適量GIMSA應用染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

3、利用Western Blot檢測LC3-II/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會酶解掉一小段多肽，轉變為(自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計自噬水平的高低。(注意: LC3對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。方法2和3需結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。小鼠成骨細胞和破骨細胞共培養模型的建立細胞之間的相互調控作用奠定基礎。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

雜交瘤細胞基因測序

雜交瘤細胞有丟失高特異性高活性的風險，或者細胞狀態不好乃至。而經過雜交瘤測序，可以獲得相應的序列，可以以重組蛋白的方式來穩定獲得；其檢測原理為活xi胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。從而使得研發或生產者不必以雜交瘤細胞為載體保留該，而可以以堿基序列的形式進行保存和傳播交流、鑒定。同時還可以使用獲得的測序結果進行等知識產權方面的申請審批。有時為了進一步大規模生產或進行人源化等生物工程操作/修飾，有必要了解雜交瘤所表達的對應的基因序列以進一步進行生物工程操作與生產。

相較于直接對進行基于蛋白質分析的測序相比，得益于基因測序技術的發展，雜交瘤測序可以提供的結果，防止蛋白測序中如亮氨酸/異亮氨酸較難區分等潛在風險。

細胞培養中常見的污染及解決方法

黑點污染

黑色的游動點能穿透濾膜并在空氣中擴散。它們在低倍鏡下顯示為黑色圓點，在高倍鏡下顯示為可移動的黑點。培養液也不渾濁，一般影響較小，因此細胞仍可使用。通常，黑點污染后，細胞生長良好，運動物體無明顯增加，培養基的顏色和透明度無明顯變化。在同一批培養的細胞中也可以發現類似的現象。25%胰酶1mMEDTA消化gao丸10min,用胎牛xue清終止消化,用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單細胞懸液,30%percoll不連續密度梯度法離心富集精原gan細胞,再根椐未分化精原gan細胞表面thy1。

解決方法：黑點對細胞生長狀態沒有明顯影響，細胞增殖后會自然消失，因此除了置換外，無需特殊處理。如果細胞可能被小的運動點污染，建議增加培養皿細胞密度，以提高細胞存活率。

關于細胞培養的常見問題:

Q: 細胞在培養過程中出現碎片如何處理？

A: 貼壁細胞在移除原培養液后，用 PBS 沖洗 2-3 遍；懸浮細胞離心移除原培養液后，加入 PBS 重懸，離心移除 PBS; 一般建議重復上述步驟 2-3 遍，用 800-1000rpm 離心 3-5 分鐘。

Q：細胞凍存能放在 -80℃ 保存嗎？

A：長期保存的細胞應當放在液氮（-196℃）中保存，短時間（一般 1 周-2 周）可以存放在 -80℃。

Q：培養瓶是用密封蓋好，還是用透氣蓋好？

A：都可以。只是在使用密封蓋培養瓶時，瓶蓋旋至約 2/3，不要完全擰緊，預留約 1/3 以便細胞可以透氣；有些品牌的密封蓋培養瓶的瓶蓋上有適合位置指示標志。

Q:何謂 FBS,FCS,CS,HS?

A: Fetal bovine serum(FBS)和 Fetal Calf Serum(FCS)之間沒有區別，都是指胎牛；FCS 不是正規命名，盡量不使用。Calf Serum（CS）則是指小牛。Horse Serum(HS)則是指馬。