細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)

1．培養(yǎng)板的預(yù)處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過(guò)夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

3．制備細(xì)胞懸液：將待測(cè)已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號(hào)zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細(xì)胞，用毛細(xì)吸管輕輕吹散細(xì)胞團(tuán)后，將懸液通過(guò)250目尼龍網(wǎng)，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計(jì)數(shù)細(xì)胞后，用1640液重新懸浮細(xì)胞，配成所需濃度；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分設(shè)備圖片公司目前擁有多項(xiàng)專(zhuān)利產(chǎn)品及技術(shù)，其中發(fā)明專(zhuān)利兩項(xiàng)，軟件著作權(quán)八項(xiàng)，實(shí)用新型專(zhuān)利三項(xiàng)，商標(biāo)兩件。

4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細(xì)胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過(guò)夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

6．加入辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

8．顯色與計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計(jì)數(shù)所顯示出的顏色的斑點(diǎn)。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)

操作步驟

1.將長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來(lái)的培養(yǎng)液棄去。

2、加入0.5- -1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。

3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細(xì)胞。觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見(jiàn)到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)zhen孔空隙時(shí)終止消化。隨著時(shí)間的推移，原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時(shí)將胰酶棄去，加入10m培養(yǎng)液終止消化。觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見(jiàn)到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)zhen孔空隙時(shí)終止消化。一般室溫消化時(shí)間約為1- -3分鐘。

4、用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，實(shí)踐培養(yǎng)液塞好橡皮塞，置37°C下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長(zhǎng)情況。

附:消化液配制方法:

稱(chēng)取0.25克胰酶蛋白酶(活力為1 : 250)， 加入100ml無(wú)Ca2+、Mg2+的Hank's液溶解，濾器過(guò)濾chu菌，4°C保存,用前可在379C下回溫。胰酶溶液中也可加入EDTA，使zui終濃度達(dá)0.02%。

雜交瘤細(xì)胞基因測(cè)序

雜交瘤細(xì)胞有丟失高特異性高活性的風(fēng)險(xiǎn)，或者細(xì)胞狀態(tài)不好乃至。BrdU染色原理BrdU(5-脫氧尿核苷)是胸腺的衍生物，常用于標(biāo)記中新合成的DNA,可代替胸腺選擇性整合到細(xì)胞中新合成的DNA中(細(xì)胞周期S期)。而經(jīng)過(guò)雜交瘤測(cè)序，可以獲得相應(yīng)的序列，可以以重組蛋白的方式來(lái)穩(wěn)定獲得；從而使得研發(fā)或生產(chǎn)者不必以雜交瘤細(xì)胞為載體保留該，而可以以堿基序列的形式進(jìn)行保存和傳播交流、鑒定。同時(shí)還可以使用獲得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行等知識(shí)產(chǎn)權(quán)方面的申請(qǐng)審批。有時(shí)為了進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)或進(jìn)行人源化等生物工程操作/修飾，有必要了解雜交瘤所表達(dá)的對(duì)應(yīng)的基因序列以進(jìn)一步進(jìn)行生物工程操作與生產(chǎn)。

相較于直接對(duì)進(jìn)行基于蛋白質(zhì)分析的測(cè)序相比，得益于基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，雜交瘤測(cè)序可以提供的結(jié)果，防止蛋白測(cè)序中如亮氨酸/異亮氨酸較難區(qū)分等潛在風(fēng)險(xiǎn)。

大鼠脂肪的分離

將手術(shù)切取的大鼠脂肪組織盡量剪碎后移至離心管，其余步驟與人脂肪的分離一致。

經(jīng)手術(shù)切除獲得的大鼠皮下脂肪組織消化后原代培養(yǎng)24 h，且肉眼觀察會(huì)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶底部貼附著一層網(wǎng)狀薄膜，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶可使這層網(wǎng)狀薄膜從瓶壁上脫落，鏡下觀 察發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞都附著于這層膜上，通過(guò)術(shù)獲取的人脂肪組織消化后則無(wú)此現(xiàn)象。共培養(yǎng)-定時(shí)間后進(jìn)行破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測(cè)，并進(jìn)一步采用RT-PCR對(duì)破骨細(xì)胞標(biāo)志酶基因基質(zhì)金屬蛋白酶。增加膠原酶的量和消化時(shí)間也無(wú)法避免，取材時(shí)的或脂肪間結(jié)締組織未被完全消化，穿過(guò)細(xì)胞篩進(jìn)入了培養(yǎng)瓶并沉淀于瓶底部形成的。膠原蛋白酶雖然可以特異性水解膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，但不會(huì)損傷其他蛋白質(zhì)。處理方法是37 ℃下用胰蛋白酶 消化5 min。然后利用40 μm的細(xì)胞篩過(guò)濾后傳代。 根據(jù)作者的經(jīng)驗(yàn)，每毫升手術(shù)切除的大鼠脂肪可分離基質(zhì)血管成分細(xì)胞約1.81×106個(gè)。原代培養(yǎng)2.24×10^7個(gè)大鼠基質(zhì)血管成分細(xì)胞，40 h后傳代時(shí)約剩余 6.2×10^6個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞剩余率27%。